OEA

Mercado Comum do Sul (MERCOSUL)

RESOLU��ES DO GRUPO MERCADO COMUM

MERCOSUL/GMC/RES N� 04/97 - ANEXO: Regulamento T�cnico para a Produ��o de Vacinas, Ant�genos e Diluentes para a Avicultura


(Continua��o)

 

II.3.b) Titula��o

As t�cnicas de titula��o s�o descritas nas normas espec�ficas de cada produto. A titula��o ser� feita como "pool" de 3 frascos em diluente apropriado. As exce��es ser�o tratadas nos produtos espec�ficos. Cada produto ter� seu t�tulo m�nimo para teste de aprova��o. As dilui��es, quando em base logar�tmica, s�o inoculadas por via adequada � cepa, m�nimo de 5 dilui��es e n�mero de 5 unidades / dilui��o. O c�lculo ser� determinado por m�todos matem�ticos tais como: Reed-Muench, Spearman-Karber, probit ou equivalente.

Os valores do resultado ser�o expressos em t�tulo/dose de vacina, com uma casa decimal significativa quando expresso em log: os valores compreendidos entre 0,01 e 0,05 = 0,0 e os valores compreendidos entre 0,06 e 0,09 = 0,1 . Quando os valores s�o expressos em unidades (PFU ou UFC / dose), esses devem ser expressos em n�meros inteiros.

II.3.c) Identidade

II.3.c.1) Identidade para bact�rias

Pelo menos um dos testes de identidade descritos a seguir deve ser conduzido para "Master Seed" bact�ria ou amostra do produto biol�gico completo. Um controle positivo fornecido ou aprovado pelo �rg�o oficial controlador deve ser usado nestes testes.

II.3.c.1.a) Teste de Anticorpo fluorescente

A t�cnica do anticorpo fluorescente deve ser conduzida usando amostra da vacina bacteriana. Fluoresc�ncia t�pica para bact�ria em quest�o deve ser demonstrada. A fluoresc�ncia n�o ocorre com controle tratado com anti-soro espec�fico.

II.3.c.1.b) Teste de aglutina��o em tubo

Cada teste deve ser conduzido com uma suspens�o vi�vel de vacina bacteriana, usando m�todo de decr�scimo constante do ant�geno com o anti-soro espec�fico. Aglutina��o t�pica para bact�ria deve ser demonstrada, a qual n�o ocorre no soro negativo usado como controle.

II.3.c.1.c) Teste de aglutina��o em placa

Deve ser conduzido usando-se suspens�es vi�veis da vacina bacteriana com o anti-soro espec�fico. Aglutina��o t�pica para bact�ria deve ser demonstrada por observa��o micro ou macrosc�pica, a qual n�o ocorre com o soro negativo usado como teste.

II.3.c.1.d) Teste de caracteriza��o

Caracteriza��o bioqu�mica ou de cultura devem ser demonstradas.

II.3.c.2) Identidade para v�rus

Pelo menos um dos testes de identidade para v�rus, descritos a seguir, deve ser realizado para cada lote de vacina:

II.3.c.2.a) Teste de anticorpo fluorescente

Este teste deve ser conduzido usando-se c�lulas inoculadas com o v�rus e c�lulas controle n�o inoculadas. As c�lulas devem ser coradas com fluoresce�na, conjugada ao anti-soro espec�fico.
Fluoresc�ncia t�pica do v�rus deve ser demonstrada nas c�lulas inoculadas. As c�lulas controle permanecem livres de fluoresc�ncia.

II.3.c.2.b) Teste de neutraliza��o do soro

Este teste deve ser conduzido usando-se o m�todo de decr�scimo constante de v�rus no soro, com anti-soro espec�fico. Para identifica��o positiva, pelo menos 100 DI 50 do v�rus de vacina devem ser neutralizadas pelo anti-soro.

II.3.d) Inocuidade

S�o utilizadas, no m�nimo, 10 aves SPF alojadas em isolamento.

Para cada grupo ser�o mantidas, no m�nimo, 10 aves controles.

Vacinas vivas: S�o inoculadas 10 doses por aves na menor idade e via recomendada pelo fabricante.

Vacinas inativadas : S�o inoculadas 2 doses por ave, na idade m�nima de 2 semanas, ou na idade m�nima indicada pelo fabricante.

As aves ser�o observadas durante o per�odo de 21 dias, verificando as rea��es adversas locais e gerais atribu�veis ao produto.

A interpreta��o do teste ser� feita de acordo com a norma espec�fica de cada produto.

II.3.e) Pat�genos estranhos

II.3.e.1) Leucose linf�ide avi�ria

Cada v�rus vacinal citop�tico a c�lulas de fibroblasto de embri�o de galinha deve ser efetivamente neutralizado, inativado ou separado, para que quantidades m�nimas do v�rus da leucose linf�ide possam ser propagadas na cultura celular durante o per�odo de crescimento de 21 dias. Se o v�rus da vacina n�o puder ser efetivamente neutralizado, inativado ou separado, uma outra amostra de vacina, preparada na mesma semana, usando material proveniente da mesma origem e lote usado para a prepara��o do v�rus da vacina em quest�o, dever� ser testada. Quando culturas celulares s�o testadas, 5 ml de suspens�o celular final preparada para semente de cultura celular da produ��o devem ser usadas como in�culo. Quando as vacinas s�o testadas, o equivalente a 200 doses de vacina contra a Doen�a de Newcastle ou 500 doses de outras vacinas para uso em aves deve ser usado como in�culo.

Culturas controle devem ser preparadas a partir da mesma suspens�o celular que as culturas para a vacina teste.

Culturas de c�lulas de fibroblasto de embri�o de galinha n�o inoculadas s�o usadas como controle negativo. Um grupo de culturas de fibroblasto, inoculado com o v�rus do subgrupo A e outro grupo inoculado com o subgrupo B, � usado como controle positivo A e B, respectivamente.

As culturas celulares devem ser propagadas a 37o C +/- 1 por, no m�nimo, 21 dias. Estas devem ser repicadas, quando necess�rio, para manter a viabilidade, e as amostras coletadas de cada passagem devem ser testadas para o ant�geno grupo-espec�fico.

O teste de microtitula��o da fixa��o do complemento deve ser realizado utilizando a t�cnica do ponto hemol�tico de 50 ou 100 %, para determinar a unidade do complemento. Cinco unidades hemol�ticas a 50 % ou duas unidades hemol�ticas a 100 % devem ser usadas para cada teste. Todos os materiais testados, incluindo controles positivos e negativos, devem ser guardados a -60o C ou congelados, at� que sejam usados no teste. Antes do uso, cada amostra deve ser descongelada e congelada 3 vezes, para romper c�lulas intactas e liberar o ant�geno grupo-espec�fico.

O anti-soro usado no teste de fixa��o do complemento deve ser um reagente padr�o. Quatro unidades de anti-soro devem ser usadas para cada teste. A presen�a de atividade fixadora do complemento nas amostras coletadas ( das passagens) na dilui��o 1:4 ou maior, na aus�ncia de atividade anti-complementar, deve ser considerada como positiva, a menos que a atividade possa definitivamente ser estabelecida como causada n�o pelo v�rus da leucose linf�ide, sub-grupos A e/ou B. A atividade na dilui��o 1:2 deve ser considerada como suspeita e a amostra deve ser posteriormente subcultivada para determinar a presen�a do ant�geno grupo-espec�fico. Pode ser utilizado o m�todo de ELISA ou outro m�todo validado. As vacinas encontradas contaminadas pelo v�rus da leucose linf�ide s�o consideradas insatisfat�rias. Os lotes de origem de material contaminado tamb�m s�o insatisfat�rios.

II.3.e.2) V�rus hemoaglutinantes

Amostras de frascos do produto final, rehidratado como descrito no r�tulo, devem ser usadas como in�culo. As vacinas avi�rias distribu�das sem diluente devem ser rehidratadas com 30 ml de �gua destilada est�ril e usadas como in�culo. Quando uma ou mais fra��es s�o usadas em combina��o com a vacina para a Doen�a de Newcastle, as amostras que ser�o testadas devem ser recolhidas de cada suspens�o, antes de serem mescladas com a vacina para a doen�a de Newcastle. Cada um de 10 ovos embrionados com 9 ou 10 dias de idade, provenientes de lote suscept�vel para a Doen�a de Newcastle, deve ser inoculado na cavidade alant�ide com 0,2 ml do in�culo n�o dilu�do.

Cinco embri�es n�o inoculados, de mesma idade e do mesmo lote daqueles usados para o teste, ser�o os controles-negativos.

Testar uma amostra do fluido alant�ico do v�rus da doen�a de Newcastle como controle- negativo.

De tr�s a cinco dias depois da inocula��o, a amostra do fluido alant�ico de cada ovo deve ser testada, separadamente, por um teste r�pido na placa , para atividade hemoaglutinante, usando uma suspens�o de 0,5 % de hem�cias frescas de galinha. Se os resultados forem inconclusivos, uma ou duas passagens devem ser feitas usando fluido de ovos originais.

Fluidos de embri�es vivos ou mortos devem ser empregados separadamente, para in�culo nestas passagens.

Se a atividade hemoaglutinante atribu�vel ao produto for observada, a partida � insatisfat�ria.

II.3.e.3) Detec��o de agentes citopatog�nicos

Corar cada camada com corante citol�gico apropriado.

Examinar a �rea total de cada monocamada corada, para evid�ncia de corpos de inclus�o , n�mero anormal de c�lulas gigantes ou outra indica��o citopatol�gica de anormalidade celular atribu�vel a agentes estranhos.

II.3.e.4) Hemoadsor��o

II.3.e.4.a) Lavar a monocamada com diversas trocas de PBS.

II.3.e.4.b) Adicionar o volume adequado de uma suspens�o a 0,2 % de hem�cias, para cobrir a superf�cie da monocamada. Suspens�es ou hem�cias lavadas de cobaia ou tipo "O" humanas devem ser usadas. Estas suspens�es devem ser misturadas antes de serem adicionadas � monocamada ou usadas separadamente em monocamadas separadas.

II.3.e.4.c) Incubar a monocamada a 4o C por 30minutos. Lavar com PBS e observar a hemoadsor��o.

II.3.e.4.d) Se a hemoadsor��o n�o for aparente, repetir o item "b" e incubar as monocamadas a 20o C - 25o C por 30 minutos. Lavar com PBS e examinar para hemoadsor��o. Se desejar, monocamadas separadas podem ser usadas para cada temperatura de incuba��o. Se citopatologia ou hemoadsor��o atribu�vel a um agente estranho for encontrada, o material testado ser� insatisfat�rio.

II.3.e.5) Detec��o de pat�genos estranhos pela inocula��o em ovos embrionados

O produto biol�gico a ser testado deve ser preparado como recomendado na bula ou , no caso de vacinas liofilizadas, rehidratado com 30 ml de �gua destilada est�ril. Um volume de vacina preparada deve ser misturado com 9 volumes de anti-soro inativado pelo calor, est�ril, espec�fico para neutralizar o v�rus vacinal. Cada lote de anti-soro deve ser certificado atrav�s do teste de neutraliza��o de v�rus que n�o inibe outros v�rus que possam ser contaminantes. Depois da neutraliza��o, 0,2 ml da mistura vacina-soro devem ser inoculados em cada um dos 30 embri�es suscept�veis. Se um v�rus "master seed" ou uma bact�ria de vacina est� sendo testada, a subst�ncia deve ser dilu�da, sendo que cada 0,2 ml cont�m v�rus neutralizado, equivalente a 10 doses de vacina.

II.3.e.5.1) Inocular a subst�ncia em 3 grupos de 10 ovos embrionados:

  • Grupo 1 - 0,2 ml na cavidade alant�ica de cada ovo com 9 a 10 dias de idade.
  • Grupo 2 - 0,2 ml na membrana corioalant�ica (CAM) de cada ovo com 9 a 10 dias de idade.
  • Grupo 3 - 0,2 ml no saco da gema de cada ovo com 5 a 6 dias de idade. Fazer ovoscopia dos ovos dos grupos 1 e 2 diariamente por7 dias e do grupo 3, por 14 dias.

II.3.e.5.2) Dispensar os embri�es que morreram nas primeiras 24 horas, com morte n�o espec�fica. O teste � v�lido se pelo menos 6 embri�es de cada grupo sobreviverem depois das primeiras 24 horas ap�s a inocula��o.

II.3.e.5.3) Examinar as anormalidades de todos os embri�es que morreram durante as 24 horas p�s-inocula��o.

Examinar tamb�m poss�veis anormalidades das membranas corioalant�icas destes ovos e testar os fluidos alant�icos para a presen�a de agentes hemoaglutinantes. Al�m disso, centrifugar em baixa velocidade os fluidos alant�icos dos ovos embrionados, inoculados via saco alant�ico, para depositar as c�lulas. Estas c�lulas s�o examinadas pelo teste de anticorpo fluorescente para o v�rus da Bronquite Infecciosa.

II.3.e.5.4) Se ocorrerem mortes ou efeitos atribu�dos ao produto, efetuar uma posterior passagem em embri�o. Fazer um "pool" de material de embri�es vivos e mortos, separadamente, e inocular cada "pool" em 10 ovos para cada uma das vias descritas no item 1; material de membrana corioalant�ica deve ser inoculado na membrana corioalant�ica ; fluidos alant�icos, na cavidade alant�ica e gema , no saco da gema.

II.3.e.6) Detec��o de Pat�genos estranhos pela inocula��o em aves

Este teste deve ser realizado se for indicado nas "master seed" ou produtos, quando o teste II.3.e.5 n�o for poss�vel, por n�o se conseguir neutralizar suficientemente o agente. O produto biol�gico a ser testado deve ser preparado como recomendado no r�tulo ou, no caso das vacinas liofilizadas , rehidratado com �gua destilada est�ril (30 ml para 1000 doses) . Pelo menos 25 aves jovens, saud�veis e suscept�veis, identificadas e obtidas do mesmo lote e galp�o, devem ser imunizadas pelo menos 14 dias antes do in�cio do teste.

O agente imunizante deve ser o mesmo que o produto a ser testado, por�m de uma partida previamente testada e aprovada.

Pelo menos 20 aves devem ser inoculadas com 10 doses de vacina a ser testada atrav�s das seguintes vias: subcut�nea, intra-traqueal, ocular e escarifica��o (1 cm 2). Vinte aves devem ser usadas para cada via ou combina��o destas. Pelo menos 5 aves devem ser isoladas como controles. Todas as aves devem ser observadas por 21 dias, para sinais de doen�as septic�micas ou respirat�rias, e outras condi��es patol�gicas. Se os controles permanecerem saud�veis e rea��es desfavor�veis ao produto ocorrerem nas aves vacinadas, a partida ser� reprovada.

Se os controles n�o permanecerem saud�veis ou se rea��es desfavor�veis n�o atribu�das ao produto ocorrerem nas aves vacinadas, ou ambos, o teste ser� inconclusivo e dever� ser repetido. Se o teste n�o for repetido, a partida ser� reprovada.

II.3.e.7) Detec��o de V�rus de Reticuloendoteliose (REV)

Inocular semente neutralizada com anti-soro monoespec�fico em 5 cultivos de fibroblastos de embri�o de galinha com 8 a 10 dias de idade, e deixar absorver durante 1 hora; em seguida, drenar os l�quidos e colocar meio de crescimento. Inocular 3 cultivos com (REV) ( controles positivos) e manter 3 cultivos como controles negativos. Os tr�s cultivos s�o incubados a 37o C +/- 1 e subcultivados duas vezes com tr�s ou quatro dias de intervalo, sendo o �ltimo subcultivo preparado sobre l�minas de 20 mm. Testar os cultivos sobre l�minas com anticorpos fluorescentes, para detectar a presen�a do v�rus de REV.

A semente ser� rejeitada se for detectado REV em qualquer uma das amostras inoculadas com a mesma.

O teste ser� validado se for detectado REV nos tr�s controles positivos e em nenhum dos tr�s controles negativos.

II.3.e.8) Detec��o do v�rus da Anemia do Frango (CAA)

Prepare 12 frascos de 25 cm3 com 20 ml de suspens�o de c�lulas fibroblast�ides MDCC - MSB1 (concentra��es de 5,0 x 105,0 c�lulas por ml). Ap�s ser neutralizado com soro monoespec�fico, o v�rus-semente � inoculado em 5 frascos. Simultaneamente ser�o inoculados 4 frascos com a cepa cux-1 de CAA como controles positivos, e ser�o mantidos 3 frascos sem inocular como controles negativos. As suspens�es s�o subcultivadas 8 vezes com intervalos de 2 a 3 dias, diluindo 1:5 em meio fresco e a 37o C +/1.

No final do per�odo de incuba��o s�o centrifugadas as c�lulas de cada suspens�o a baixa velocidade (400 G) por 10 minutos e s�o ressuspendidas a 106,0 c�lulas por ml. Volumes de 25 microlitros s�o colocados em cavidades de uma l�mina multiescavada e depois de sec�-las com ar o teste de imunofluoresc�ncia indireta (IFI) lhe � aplicado. Durante as subculturas, a presen�a de CAA pode ser evidenciada pela mudan�a de colora��o nas culturas infectadas, onde os flu�dos se tornam vermelhos em compara��o com as culturas-controle. Se em algum est�gio uma mudan�a de cor metab�lica sugerir a presen�a de CAA, o IFI dever� ser executado para confirmar a observa��o. A semente ser� rejeitada se o teste de CAA for positivo em qualquer das suspens�es inoculadas com a mesma. O teste � valido se o CAA for detectado nos 4 controles positivos e em nenhum dos controles negativos.

II.3.f) Inativa��o

Cada lote de ant�geno para prepara��o de vacinas inativadas deve ser testado em substratos espec�ficos para a detec��o de total inativa��o, conforme descrito no item espec�fico do produto.

II.3.g) Efic�cia

Para aferir a efic�cia do produto final deve ser utilizado um teste em aves SPF ou seja, sorologia e/ou pot�ncia (DP 50 ou % de prote��o) e/ou outros testes validados pelo �rg�o oficial controlador, que certificar� as cepas do desafio. Os testes realizados com cepas n�o certificadas n�o ter�o valor legal.

II.3.g.1) Sorologia

Ser�o vacinadas 20 aves SPF, na idade m�nima de 2 a 4 semanas , pela via indicada pelo fabricante. Para cada lote ser�o mantidos, no m�nimo, 5 testemunhos. Vinte e um dia ap�s a vacina��o, as aves ser�o sangradas, para avalia��o sorol�gica (�ndice de soroconvers�o). Os n�veis de soroconvers�o s�o definidos nos itens espec�ficos de cada produto.

II. 3.g.2) Pot�ncia

II.3.g.2.1) DP 50 A prote��o � aferida utilizando-se 4 grupos de 20 aves oriundas de plant�is SPF, com idade m�nima indicada pelo fabricante, reservando-se um dos grupos como testemunho. Os lotes s�o vacinados com 1/100, 1/50 e 1/25 de dose, utilizando uma seringa microm�trica. A vacina poder� ser dilu�da em um diluente que n�o afete a pot�ncia e/ou condi��es f�sicas originais da vacina, devidamente comprovadas. Decorridos 21 dias as aves s�o inoculadas pela via adequada � cepa de desafio, com dose infectante suficiente para apresentar 90 % de infec��o nos testemunhos de uma amostra no v�rus- padr�o, certificada pelo �rg�o oficial controlador. As aves s�o observadas diariamente por um per�odo m�nimo de 10 dias, e o grupo testemunho deve apresentar, no m�nimo, 90 % de infec��o. O n�mero de aves de cada grupo que sobreviver sem mostrar qualquer evid�ncia cl�nica da doen�a em quest�o � anotado, e a pot�ncia da vacina � calculada pelo m�todo estat�stico padr�o, devendo ser definido para cada v�rus com limite inferior de confian�a (p= 0,95) definido em cada produto.

II.3.g.2.2) % Prote��o de acordo com cada doen�a espec�fica

II.3.g.2.3) Imunogenicidade

Cada lote de v�rus "master seed", usado para a produ��o de vacinas, deve ser testado conforme descrito para as normas espec�ficas de cada produto. O v�rus "master seed" deve ser retestado para imunogenicidade a cada 3 anos, a menos que o uso do lote previamente testado tenha sido descontinuado. Somente uma via de administra��o, recomendada na bula, necessita ser usada no reteste.

II.3.h) Testes F�sico-qu�micos

II.3.h.1) Umidade residual

A umidade residual ser� verificada atrav�s de m�todos convencionais, e deve ser, no m�ximo, de 3 %.

II.3.h.2) V�cuo / g�s inerte

O v�cuo / g�s inerte deve ser satisfat�rio e pesquis�vel atrav�s do detector de v�cuo, sendo o g�s inerte pesquisado conforme indica��o t�cnica fornecida pelo fabricante.

II.3.h.3) pH

A concentra��o hidrog�nica deve ser determinada atrav�s de peag�metro[sic.] aferido em solu��o tamp�o de pH, imediatamente antes do uso. O pH deve ser espec�fico para cada produto.

II.3.h.4) Volume

Todo produto l�quido, medido entre 22o C a 25o C, deve conter o volume indicado no r�tulo, aferido por metodologia validada.

II.3.h.5) Viscosidade

� compat�vel com o tipo de emuls�o definida pelo fabricante do produto.

II.3.h.6) Estabilidade

� compat�vel com o tipo de emuls�o definida pelo fabricante, conforme descri��o da metodologia no relat�rio de registro do produto.

II.3.h.7) Concentra��o

O volume celular pode ser avaliado por espectrofotometria ou PCV (m�todo de Fitsch- Hopkins).

II.3.h.8) Sensibilidade

Cada lote de ant�geno dever� ser testado frente a soros-padr�o monoespec�ficos positivos e negativos, ou outros reconhecidos pelo �rg�o oficial controlador.

II.3.h.9) Tempo de reconstitui��o

Quando adicionados os diluentes aos produtos liofilizados, estes dever�o apresentar tempo de reconstitui��o igual ou menor a 60 segundos. II.3.h.10 Osmolaridade A osmolaridade � aferida pelo teste de osmometria, e os produtos devem estar entre os valores de 260 a 320 mohms.

II.4. DA COMERCIALIZA��O E USO

II.4.a) Prazo de Validade

O prazo de validade ser� definido no regulamento espec�fico para cada produto. No caso de produtos associados, prevalecer� o menor prazo.

II.4.b) Conserva��o e estocagem

Definidas de acordo com o regulamento espec�fico de cada produto.

II.4.c) Transporte

De acordo com regulamento espec�fico de cada produto.

II.4.d) Biosseguran�a

De acordo com regulamento espec�fico de cada produto.

II.4.e) Uso e via de aplica��o

De acordo com regulamento espec�fico de cada produto.

 

Continua��o: Cap�tulo III - Vacinas Vivas